一、双酶切构建载体方法

　　首先，对引物的设计有着严格的要求，引物的长度一般为18-25bp，GC含量控制在40%-60%，上、下游引物之间GC含量不能相差太大，引物中需要加入酶切位点及保护性碱基。引物设计不当可能在扩增时生成引物二聚体，给实验带来不便。

　　其次，目的基因有必要进行TA克隆。在后续的实验操作中，可能会由于酶切效率和连接效率低等原因使得载体构建相当困难，目的基因扩增在这些步骤之前，由于PCR扩增是体外扩增，很容易发生突变，TA克隆有着成功率高的优点，通过TA克隆将目的基因构建进pMD19T进而转化入大肠杆菌中，单克隆菌体自身的修复机制可保证单一的克隆，利于筛选需要的序列，通过后续测序鉴定可以得到大量正确的目的基因片段，而且直接将PCR产物切下来不易产生粘性末端，连接入表达载体比较困难，通过TA克隆酶切的目的片段产生粘性末端的概率很高。

　　第三，双酶切效率不高。由于不同的酶所对应的缓冲液不同，内切酶只有在缓冲液环境下效率才能得到优化，但是双酶切体系势必使其中一个酶的活性有所损失。这样必定会使酶切产物不纯。酶切产物中既有单酶切线性载体，也有双酶切线性载体，使得连接时所需要的双酶切线性载体的量失准，影响连接效率。因此可以先用一个控制性内切酶切割纯化回收，但工作量较大，回收率低。

　　第四，连接效率低。pMIR reporter与目的片段的摩尔比很重要，一般在3:1-10:1间浮动，而且连接效率和连接反应体积也有关系。

　　二、同源重组法构建载体

　　采用同源重组法构建载体与常规双酶切构建载体方法不同。首先，设计引物时上游引物5’端前面加的是酶切位点（如 Hind III）及该酶切位点在pMIR reporter载体中对应前面的15个碱基载体片段，下游引物5’端前面加的是HindIII酶切位点及该酶切位点在pMIR reporter载体中对应后面的15个碱基载体片段，如此设计引物是为了保证目的片段插入载体时方向正确。其次，载体只需要单酶切，用Hind III酶切pMIR reporter，使得pMIR reporter成为两端都带着Hind III位点的线性载体。相比双酶切切割载体，单酶切可以保证酶切后的载体都是单一的线性片段，使得后续的重组连接更准确。第三，省去了TA克隆环节。因为PCR产物可以直接用于重组连接，不需要酶切产生粘性末端，而且重组酶的重组能力强于T4DNA连接酶的连接能力，一般只需要一步即可重组连接成功，因此可以在重组反应之后进行测序鉴定。