慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。具有感染谱广泛、可以有效感染分 裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、microRNA研究以及活体动物实验中。

　　本公司慢病毒包装系统采用常用的第二代3质粒包装系统，慢病毒穿梭质粒（Lentiviral-shuttlevector，pLenti-X-puro）及其辅助包装原件载体质粒（psPAX2和pMD2.G），大大降低了发生同源重组的概率，降低了产生复制能力病毒的可能性。同时，本系统的慢病毒颗粒是自身失活型（SIV）病毒，即病毒感染靶细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，从而提高了安全性。

　　本公司提供shRNA干扰慢病毒、gRNA慢病毒等定制 服务：

　　1.重组慢病毒穿梭质粒设计不同组织特异性启动子，包装的病毒感染特定组织细胞，整合到基因组，达到稳定表达蛋白。慢病毒穿梭质粒（Lentiviral-shuttlevector）带有puromycin抗性基因，包装的病毒在感染目的靶细胞后，可通过加入puromycin进行选择性筛选，从而获得稳定表达shRNA或者稳定表达特定基因的细胞株。

　　2.可设计具有带有U6启动子的sgRNA及CRISPR/Cas9慢病毒穿梭质粒，包装病毒用于靶向敲除基因。

　　3.人工设计合成的shRNA/miRNA引入慢病毒穿梭质粒，包装的病毒感染靶细胞后可干扰目标基因的表达。

　　本公司通过超滤浓缩纯化病毒，可产出高滴度慢病毒，可高效感染靶组织或靶细胞。

　　应用实例

Cell，2015，160(6)，1246-1260

　　慢病毒介导的sgRNA基因敲除系统，在肺癌细胞中的应用

　　A：利用慢病毒建立Cas9-GFPKPD非小细胞肺癌细胞系，将靶向多个基因的sgRNA慢病毒感染上述细胞系，再将该细胞系注射至Nu/Nu免疫缺陷小鼠皮下，以观察肿瘤细胞的肺转移；B：注射一周后，检测发现与肿瘤细胞生长相关的Nrf2和Pten蛋白的表达量显著降低。

 

 

　　逆转录病毒是一类RNA病毒，它能在逆转录酶的作用下，将RNA反转录成cDNA，再经过DNA复制/转录/翻译等蛋白酶作用扩增形成病毒。逆转录病毒的DNA基因组整合到宿主染色体上位点是随机的。

　　本公司逆转录病毒采用3质粒系统：

　　逆转录病毒包装辅助质粒pCMV-gag-pol和包膜质粒pCMV-VSV-G，逆转录病毒表达载体pSuper-retro-puro或pMSCV-puro。

　　在逆转录病毒表达载体设计不同组织特异性启动子，产生的病毒可靶向感染特定组织细胞，用于稳定表达目的基因，同时目的基因可整合靶细胞的基因组，用来构建细胞稳住，可进一步用于药物筛选等。

 

　　重组腺病毒（AdV）是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。目前常用的腺病毒载体基于人腺病毒5型（Ad5），其基因组是36kb长的线性双链DNA。腺病毒可通过自身的纤维（fiber）和细胞表面的受体结合被内吞进入细胞，然后从内吞体（endosome）转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装。一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。在腺病毒生产和使用过程中，除293细胞能提供反式E1蛋白外，其它细胞都不能进行腺病毒扩增，因此大大提高了生物安全性，获得的重组病毒非常稳定。

　　本公司的腺病毒包装采用单质粒的AdEasy包装系统。目的基因克隆至腺病毒穿梭质粒（pAdtrack-CMV），将穿梭质粒线性化后与腺病毒骨架质粒利用同源重组获得重组腺病毒质粒，转染293A细胞包装病毒。

　　本公司提供以下服务：

　　1.可以将外源目的DNA序列或目的shRNA/miRNA克隆至腺病毒的穿梭载体，进一步包装成腺病毒，用于过表达外源基因或者干扰相关基因的表达。

　　2.可设计具有sgRNA及CRISPR/Cas9的腺病毒质粒，包装病毒，用于靶向敲除基因。

　　应用实例

　　腺病毒感染细胞应用（a）图：PAdeasy-GFP在293细胞的表达。（b）图：带GFP的腺病毒感染原代肝细胞48-72h的荧光图像。

　　腺病毒介导的shRNA干扰作用在小鼠肌肉中的应用：

　　在小鼠的两条腿的胫骨前肌分别注射对照腺病毒和装载Baf60c(smarcd3)干扰片段的腺病毒，每天两次，连续两天，5天后取肌肉组织，QPCR检测Baf60c的表达情况，Western blot检测信号通路蛋白的表达情况，以及组织染色。

 

　　腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。

　　AAV基因组包含3个启动子P5、P19、P40，基因组中间含有两个开放阅读框（ORF），从左往右依次为Rep基因和Cap基因。启动子P5和P19负责Rep基因的转录，参与Rep78，Rep68，Rep52，Rep40这4个非结构蛋白的合成，这四种蛋白主要负责病毒基因组的复制、转录调控、位点特异性整合等。Cap基因编码3个衣壳蛋白不同剪切体VP1、VP2和VP3，构成AAV的衣壳（VP1、VP2、VP3的比例约为1:1:10），由启动子P40负责转录。

　　重组腺相关病毒载体（AAV）所包含的DNA一般是用外源基因表达元件替换AAV的编码基因，仅保留了病毒复制和包装所需的ITR序列。通过反式补偿Rep基因、Cap基因和辅助病毒功能因子包装产生的携带外源DNA。AAV具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、能介导基因在动物体内长期稳定表达等特点，是一种重要的携带外源基因病毒工具，被广泛用于生命科学研究，是重要的基因治疗载体之一。

　　研究发现AAV具有多种血清型，各种不同血清型的AAV载体的主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。AAV病毒包装所用载体没有任何共同区域，避免通过重组而恢复出野生型病毒，宿主细胞免疫反应被降至低，从而允许对具有免疫能力的宿主细胞进行基因传递，重组AAV在理论上也不具有复制的能力。

　　建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒。

　　腺相关病毒基因传递的优势

　　1.宿主范围广：AAV可高效感染分化和非分化细胞；

　　2.多种血清型：AAV1，AAV2，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9和AAV2/BBB等；

　　3.安全性高：ITR序列和rep/cap基因分别由独立的质粒表达；未发现AAV对人体致病，rAAV去除了wtAAV基因组的96%，从而进一步保证了其安全性；

　　4.免疫原性低：AAV2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；

　　5.载体多样性：不同的启动子（神经特异性启动子Human Synapsin、CamkIIα和GFAP等）和多种报告基因（EGFP、mCherry、RFP和luciferase等）可供客户选择；

　　6.滴度高：可提供1012V.G/ml及以上滴度的病毒.，高可达1014V.G/ml；

　　荣森基因AAV服务：

　　（a）根据客户需要提供AAV载体相关基因编辑，包括基因重组、sgRNA以及shRNA/miRNA设计和构建（包括多重靶向编辑）等。

　　（b）AAV包装纯化以及滴度和纯度检测，包括以下：

　　基因过表达AAV；

　　靶向敲除基因的sgRNA及CRISPR/Cas9相关AAV；

　　干扰基因表达的shRNA/miRNA相关AAV；

　　病毒生产流程：

　　应用实例

(A)

(B)

　　图（A）为AAV2/9-CAG-GFP病毒在骨骼肌表达，取样时间为注射后一个月。

　　图（B）为AAV2/8-TBG-GFP病毒在肝脏表达，取样时间为注射后一个月。

AAV在肝脏中的应用

　　本公司AAV病毒包装采用3质粒系统：穿梭重组质粒pAAV-shuttler，辅助质粒AdHelperVector（pAdDeltaF6）和包装质粒pAAV-rep/capVector。

 

Cell,2015,160(6),1246-1260

　　慢病毒介导的sgRNA基因敲除系统，在肺癌细胞中的应用

　　A：利用慢病毒建立Cas9-GFPKPD非小细胞肺癌细胞系，将靶向多个基因的sgRNA慢病毒感染上述细胞系，再将该细胞系注射至Nu/Nu免疫缺陷小鼠皮下，以观察肿瘤细胞的肺转移；B：注射一周后，检测发现与肿瘤细胞生长相关的Nrf2和Pten蛋白的表达量显著降低。

 

　　腺病毒感染细胞应用（a）图：PAdeasy-GFP在293细胞的表达。（b）图：带GFP的腺病毒感染原代肝细胞48-72h的荧光图像。

　　腺病毒介导的shRNA干扰作用在小鼠肌肉中的应用：

　　在小鼠的两条腿的胫骨前肌分别注射对照腺病毒和装载Baf60c(smarcd3)干扰片段的腺病毒，每天两次，连续两天，5天后取肌肉组织，QPCR检测Baf60c的表达情况，Westernblot检测信号通路蛋白的表达情况，以及组织染色。

 

a

b

　　图（A）为AAV2/9-CAG-GFP病毒在骨骼肌表达，取样时间为注射后一个月。

　　图（B）为AAV2/8-TBG-GFP病毒在肝脏表达，取样时间为注射后一个月。

AAV在肝脏中的应用

　　本公司AAV病毒包装采用3质粒系统：穿梭重组质粒pAAV-shuttler，辅助质粒AdHelperVector（pAdDeltaF6）和包装质粒pAAV-rep/capVector。

 

【1】Deverman B E , Pravdo P L , Simpson B P , et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain[J]. Nature Biotechnology, 2016.

【2】Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity[J]. Nature, 2013, 499(7458):295-300.

【3】Tabebordbar M , Zhu K , Cheng J K W , et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells[J]. Science, 2015, 351(6271):407-411.

【4】Li Ni et al.Atrial-Specific Gene Delivery Using an Adeno-Associated Viral Vector.Circ. Res. 2019 01 18;124(2)

【5】Wang Z , Zhu T , Qiao C , et al. Adeno-associated virus serotype 8 efficiently delivers genes to muscle and heart[J]. NATURE BIOTECHNOLOGY, 2005, 23(3):321-328.