1.AAV病毒载体有CMV（全身表达）、CAG（全身表达）、TBG（肝脏特异性）、Insulin（胰岛Beta细胞特异性）、CK8（肌肉特异性）、tMCK（肌肉特异性）、Adiponectin（脂肪细胞特异性）、Syn(神经特异性)、CaMKIIa(神经特异性)等，根据需要可包装对特定组织或细胞感染的AAV，用于表达目的基因。

　　2.荧光蛋白标记载体：具有表达GFP、mCherry等AAV表达载体。

　　3.具有靶向编辑基因AAV载体系统：CRISPR/Cas9（sgRNA）介导的基因编辑系统和shRNA介导的基因敲减系统。

 

参考文献

1. Wang RR et al, (2022) Dietary intervention preserves β cell function in mice through CTCF-mediated transcriptional reprogramming. Journal of Experimental Medicine. IF: 14.41, (AAV)

2. Qiao J et al (2022) A distinct role of STING in regulating glucose homeostasis through insulin sensitivity and insulin secretion. PNAS. IF=11.2, (AAV)

3. Ji F et al (2022) Blocking hepatocarcinogenesis by a cytochrome P450 family member with female-preferential expression. Gut. IF=23, (AAV)

4. Ma XR et al (2022) Restoring nuclear entry of Sirtuin 2 in oligodendrocyte progenitor cells promotes remyelination during ageing. Nature Communications. IF=14.9, (慢病毒)

5. Wang RR et al, (2022) Dietary intervention preserves β cell function in mice through CTCF-mediated transcriptional reprogramming. Journal of Experimental Medicine. IF: 14.41, (AAV)

6. Xu Z et al, (2022) Disuse-associated loss of the protease LONP1 in muscle impairs mitochondrial function and causes reduced skeletal muscle mass and strength. Nature Communications. IF: 14.9, (AAV)

7. He S et al, (2021) IRE1α regulates skeletal muscle regeneration through Myostatin mRNA decay. J Clin Invest. IF: 15.86, (AAV)

8. Wang J et al, (2021) Leukocyte cell-derived chemotaxin 2 promotes the development of nonalcoholic fatty liver disease through STAT-1 pathway in mice. Liver International. IF: 5.17, (AAV)

9. Liu T et al, (2020) BAF60a deficiency uncouples chromatin accessibility and cold sensitivity from white fat browning. Nature Communications. IF=12.35, (逆转录病毒, AAV)

10. Hu Z et al, (2019) CREBZF as a key Regulator of STAT3 Pathway in the Control of Liver Regeneration in Mice. Hepatology. IF=14.08, (腺病毒，AAV)

11. Wang X et al, (2019) The zinc transporter Slc39a5 controls glucose sensing and insulin secretion in pancreatic β-cells via Sirt1- and Pgc-1α-mediated regulation of Glut2. Protein Cell. IF=6.228, (腺病毒)

12. Liu L et al, (2019) Coupling of COPII vesicle trafficking to nutrient availability by the IRE1α-XBP1s axis. PNAS. June 11; 116 (24) 11776-11785. IF=9.504, (AAV，腺病毒)

13. Li Y et al, (2019) MiR-223 is essential for maintaining functional β-cell mass during diabetes through targeting unique bipartite Foxo1 and Sox6 pathways. Journal of Biological Chemistry. IF=4.01, (腺病毒)

14. Zhao XY et al, (2018) Long noncoding RNA licensing of obesity-linked hepatic lipogenesis and NAFLD pathogenesis. Nature Communications. IF=12.35, (AAV，腺病毒)

15. Zhang F et al, (2018) Hepatic CREBZF Couples Insulin to Lipogenesis by Inhibiting Insig activity and Contributes to Hepatic Steatosis in Diet-Induced Insulin-Resistant Mice. Hepatology. IF=14.079, (腺病毒)

16. Guo L et al, (2017) Hepatic neuregulin 4 signaling defines an endocrine checkpoint for steatosis-to-NASH progression. J Clin Invest. IF=12.28, (腺病毒，AAV)

17. Meng ZX et al, (2018) Uncoupling exercise bioenergetics from systemic metabolic homeostasis by conditional inactivation of Baf60s in skeletal muscle. Diabetes. IF: 7.72, (逆转录病毒, 腺病毒)

18. Zhang D et al, (2017) Lipogenic transcription factor ChREBP mediates fructose-induced metabolic adaptations to prevent hepatotoxicity. J Clin Invest. IF=12.28, (腺病毒)

19. Meng ZX et al, (2017) Glucose sensing by skeletal myocytes couples nutrient signaling to systemic homeostasis. Molecular Cell. IF: 15.58, (逆转录病毒, 腺病毒)

 

　　1.采用pAdeasy腺病毒载体系统，并有多种全身和组织特异性启动子可供选择：CMV（全身表达）、CAG（全身表达）、TBG（肝脏特异性）、Insulin（胰岛Beta细胞特异性）、CK8（肌肉特异性）、tMCK（肌肉特异性）、Adiponectin（脂肪细胞特异性）、Syn(神经特异性)、CamkIIa(神经特异性)等。

　　2.荧光蛋白标记载体：具有表达GFP、mCherry等腺病毒载体。

　　3.具有靶向基因编辑腺病毒载体系统：CRISPR/Cas9（sgRNA）介导的基因编辑系统和shRNA介导的基因敲减系统。

　　1.外源目的基因过表达慢病毒包装；

　　2.设计带有sgRNA及CRISPR/Cas9慢病毒穿梭质粒，包装病毒用于靶向敲除基因。

　　3.人工设计合成的shRNA引入慢病毒穿梭质粒，包装的病毒感染靶细胞后可干扰目标基因的表达。

　　1.外源目的基因过表达逆转录病毒包装；

　　2.可设计具有带有U6启动子的sgRNA及CRISPR/Cas9逆转录病毒穿梭质粒，包装病毒用于靶向敲除基因；

　　3.人工设计合成的shRNA引入逆转录病毒穿梭质粒，包装的病毒感染靶细胞后可干扰目标基因的表达。

 

　　CRISPR-Cas9系统是细菌在与噬菌体抗争的进化过程中产生的一种抵御外源DNA入侵的机制，能有效识别并剪切外源DNA。基于其识别切除外源DNA的原理，CRISPR-Cas9系统被开发成为新一代基因编辑工具。与ES打靶、ZFN、TALEN等技术途径相比，CRISPR-Cas9系统操作简便、效率高、成本低，有着极其广阔的应用前景。

　　CRISPR RNA(crRNA)：指的是一个含有42个碱基的小RNA，它的5’是20个可以和目标DNA配对的碱基，所以是可变的；它的3’是22个不变的碱基，术语叫”repeat”

　　trans-activating crRNA (tracrRNA)：指的是一个大概含有87个碱基的小RNA，它的5’可以和crRNA的3’“repeat”配对，术语叫做”anti-repeat”，除此之外，其它部分可以形成hairpin样的二级结构。

　　crRNA和tracrRNA结合在一起后可以与Cas9结合，然后通过那20个可变的RNA识别含有PAM的genomic DNA。

　　CRISPR-Cas9系统的一大改进是，将crRNA、tracrRNA所组成的双链RNA结构改造成为发夹样的单链导向RNA(Single-guideRNA，sgRNA/gRNA)。其中，gRNA5′端的前20个核苷酸相当于crRNA序列，可以与靶基因片段互补结合，gRNA同样能够指导Cas9蛋白特异切割双链DNA，进一步简化了CRISPR-Cas9系统的操作环节.

　　Cas9识别位点的特异性就由20个碱基的向导序列和3个碱基的PAM序列共同决定。一旦基因组序列中出现由于gRNA引导的Cas9切割DNA断口，细胞内的非同源末端连接修复机制和同源重组修复机制就会启动，而非同源末端连接修复机制会造成基因组序列的突变和移码，从而有一定概率出现目的基因的序列突变和蛋白翻译提前终止。

　　CRISPR/Cas9是一种能够对任何物种基因组的特定位点进行精确编辑的技术。使用该技术能够进行细胞水平和动物水平的单基因或多基因的组成型/条件性/组织特异性敲除，敲入或定点突变。其原理是Cas9蛋白通过导向性RNA(guideRNA，gRNA)识别特定基因组位点并进行剪切。

 

　　shRNA是英文单词short hairpin RNA的缩写。翻译为“短发夹RNA”。shRNA包括两个短反向重复序列。克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。

　　在活体中输送“小干扰RNA”（siRNA）的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”克隆进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”（dsRNA），并被RNAi通道处理。

 

　　客户将向我们提供含有靶基因的质粒或靶基因的GenBank编号/序列文件，以及所需基因的目的质粒。我们将设计一种将靶基因克隆到目的质粒中的策略，并通过控制酶消化和精确序列分析验证所得构建体客户将向我们提供含有靶基因的质粒或靶基因的GenBank编号/序列文件，以及所需基因的目的质粒。我们将设计一种将靶基因克隆到目的质粒中的策略，并通过控制酶消化和精确序列分析验证所得构建体。

　　一、双酶切构建载体方法

　　首先，对引物的设计有着严格的要求，引物的长度一般为18-25bp，GC含量控制在40%-60%，上、下游引物之间GC含量不能相差太大，引物中需要加入酶切位点及保护性碱基。引物设计不当可能在扩增时生成引物二聚体，给实验带来不便。

　　其次，目的基因有必要进行TA克隆。在后续的实验操作中，可能会由于酶切效率和连接效率低等原因使得载体构建相当困难，目的基因扩增在这些步骤之前，由于PCR扩增是体外扩增，很容易发生突变，TA克隆有着成功率高的优点，通过TA克隆将目的基因构建进pMD19T进而转化入大肠杆菌中，单克隆菌体自身的修复机制可保证单一的克隆，利于筛选需要的序列，通过后续测序鉴定可以得到大量正确的目的基因片段，而且直接将PCR产物切下来不易产生粘性末端，连接入表达载体比较困难，通过TA克隆酶切的目的片段产生粘性末端的概率很高。

　　第三，双酶切效率不高。由于不同的酶所对应的缓冲液不同，内切酶只有在缓冲液环境下效率才能得到优化，但是双酶切体系势必使其中一个酶的活性有所损失。这样必定会使酶切产物不纯。酶切产物中既有单酶切线性载体，也有双酶切线性载体，使得连接时所需要的双酶切线性载体的量失准，影响连接效率。因此可以先用一个控制性内切酶切割纯化回收，但工作量较大，回收率低。

　　第四，连接效率低。pMIR reporter与目的片段的摩尔比很重要，一般在3:1-10:1间浮动，而且连接效率和连接反应体积也有关系。

　　二、同源重组法构建载体

　　采用同源重组法构建载体与常规双酶切构建载体方法不同。首先，设计引物时上游引物5’端前面加的是酶切位点（如 Hind III）及该酶切位点在pMIR reporter载体中对应前面的15个碱基载体片段，下游引物5’端前面加的是HindIII酶切位点及该酶切位点在pMIR reporter载体中对应后面的15个碱基载体片段，如此设计引物是为了保证目的片段插入载体时方向正确。其次，载体只需要单酶切，用Hind III酶切pMIR reporter，使得pMIR reporter成为两端都带着Hind III位点的线性载体。相比双酶切切割载体，单酶切可以保证酶切后的载体都是单一的线性片段，使得后续的重组连接更准确。第三，省去了TA克隆环节。因为PCR产物可以直接用于重组连接，不需要酶切产生粘性末端，而且重组酶的重组能力强于T4DNA连接酶的连接能力，一般只需要一步即可重组连接成功，因此可以在重组反应之后进行测序鉴定。